Казанкин Д. С. Удмуртский Государственный Университет, Биолого-химический факультет

Одно чаньское изречение гласит: "Уток, вышитых на ковре, можно показать другим. Но игла, которой их вышивали, бесследно ушла из вышивки", точно так же и попытки изучать жизнь по мертвым препаратам обречены на провал a priori. Живые клетки очень сложный объект для исследования. Многие методики широко применяемые для фиксированных препаратов совершенно неприемлемы для живых объектов т.к. могут разрушить клетку или изменить ее метаболизм (например, электронная микроскопия). Но некоторые методики можно использовать если несколько видоизменить их. При работе с различными биологическими молекулами очень широко применяют электрофорез. Это явление открыто русским ученым Ф. Ф. Рейссом в 1807 году.

    Особенно широкое распространение получил этот метод после того как были усовершенствованы методы электрофореза, в частности, предложены оптические методы регистрации подвижной границы в жидких средах и начали использоваться в качестве носителя бумага, гели и порошки. В результате значительно расширилась область применения метода электрофореза и он успешно используется для исследования самых различных биологических объектов.

    В последнее время этот метод все шире используется для прижизненного изучения клеток различных организмов. Живые клетки, так же как и высокомолекулярные вещества организма, при физиологическом значении рН несут на своей поверхности избыточный отрицательный заряд, который образуется вследствие диссоциации ионогенных, преимущественно кислотных, групп клеточной мембраны. Электрический заряд клеток играет важную роль в газообмене, адсорбции веществ из внешней среды, образовании структуры клеточных скоплений и во всех остальных физиологических проявлениях жизни.

    В отличие от высокомолекулярных веществ электрокинетическое движение клеток происходит по другим принципам.

Общий дипольный момент клетки.

    Прежде всего любую клетку можно рассматривать как конгломерат биологических молекул, в основном представленных в виде диполей. На частицу, находящуюся в электрическом поле с напряженностью Е, действует сила F = QE, которая и приводит к движению этой частицы. Если поместить клетку в электрическое поле, то на каждый диполь будет действовать электрофоретическая сила. Суммарная сила приводящая к движению клетки складывается из отдельных электрокинетических сил. В этом отношении клетки не отличаются от крупных молекул (ДНК, белки).

    Но кроме этого для клеток характерны особые свойства, например двойной электрический слой, который окружает клетку и легко смещается во внешнем электрическом поле.

    Клетки, которые находятся в электролите, благодаря наличию на своей поверхности электрического заряда притягивают противоины из окружающей среды, которые стремятся приблизиться к ионизированным группам клеточной мембраны, за счет межмолекулярного взаимодействия. Временные связи, образованные электростатическим притяжением, - полярные, ненаправленные и ненасыщаемые. Это означает, что клетка, имеющая на своей поверхности определенный заряд, стремится притянуть все противоположные по знаку частицы, присутствующие в растворе, но диффузия и тепловое движение молекул не позволяет образовываться большим скоплениям противоионов вокруг клетки. В то же время вблизи поверхности клетки сила электростатического притяжения преобладает и противоионы и диполи воды образуют, так называемый, двойной электрический слой.

    Согласно первоначальному представлению, структура двойного электрического слоя отождествляется с плоским жидкостным конденсатором, одна обкладка которого связана непосредственно со стенкой частицы или клетки, а другая, несущая противоположный знак, принадлежит среде. При этом расстояние между обкладками соответствует величине удвоенного радиуса ионов (Г. Гельмгольц и Ж. Перрен).

    Но так как возникали трудности в объяснении многих электрокинетических явлений в коллоидных системах, точка зрения Г. Гельмгольца и Ж. Перрена вскоре, была дополнена новой теорией о диффузной структуре двойного электрического слоя (М. Гуи, 1936; О. Штерн, 1936).

    Согласно этой теории двойной электрический слой коллоидных частиц или клеток формируется под влиянием двух противоположно действующих сил - электростатического притяжения и теплового движения ионов. Электростатические силы стремятся сосредоточить возможно большее количество противоионов вблизи заряженной поверхности клетки, а молекулярное тепловое движение способствует их равномерному распределению во всем объеме суспензирующей среды. В результате действия этих двух противоположно направленных сил вокруг частицы или клетки ионы статически распределяются таким образом, что вблизи поверхности клетки число противоположно заряженных ионов в среднем во времени будет больше, а число одноименно заряженных - меньше, чем в окружающей среде, в которой их концентрации равны.

    Следовательно, вокруг частицы или клетки образуется ионная атмосфера с избыточным диффузным зарядом, который является наружной обкладкой двойного слоя. Наиболее высокая плотность электрического заряда двойного слоя вблизи поверхности клетки, при удалении от нее в глубину раствора плотность заряда постепенно уменьшается до нуля.

    Толщина двойного электрического слоя клетки зависит от ионной силы суспензирующего раствора. При высокой ионной силе раствора двойной электрический слой клетки сжимается, приближаясь по своей структуре к слою Г. Гельмгольца - Ж. Перрена, а при низкой ионной силе он увеличивается, соответствуя диффузному слою М. Гуи - О. Штерна.

    Например, если ионная сила раствора 0,145 (величина ионной силы плазмы крови человека), - толщина двойного слоя эритроцитов равна 8 А, то при уменьшении ионной силы в 10 раз, т. е. до 0,0145, толщина двойного слоя увеличивается до 25 А.

    Если поместить клетку в однородное электрическое поле с постоянными знаками электродов, то оно приведет к деформации двойного электрического слоя (показано на рисунке 1а)

Рисунок 1.

    Как правило частица и окружающая ее среда различаются по электрическим характеристикам (т.е. по проводимости и диэлектрической константе). Это различие проявляется при воздействии на суспензию электрического поля. На границе раздела двух фаз скапливаются наведенные электрические заряды, которые стремятся уменьшить различия в электрических характеристиках частицы и среды. Впервые этот эффект описали Максвелл и Вагнер (Maxwell, J. C. (1891) A Treatise on Electricity and Magnetism, 3rd. ed., Vol.1, Ch.ix, Clarendon Press, Oxford; Wagner, K. W. (1914) Archiv. Elektrotechnik 2, S.371-389). На рисунке 1(б) показана вынужденная поляризация вызванная различием электрических характеристик клетки и окружающей ее среды.

    Смещение двойного электрического слоя и образование Максвелл-Вагнеровского заряда на разделе фаз придают клетке свойства электрического диполя. Его величина очень большая в сравнении с таковой обычных диполей образующихся на молекулах разных видов. Это объясняется большим расстоянием между противоположно заряженными концами клетки. Даже если разделенный заряд невелик, дипольный момент достигает огромных величин. Например, если разделенный заряд q эквивалентен всего лишь заряду одного электрона (1,6022х10^-19 Кл), тогда для клетки с диаметром 5 микрон дипольный момент будет около 2,5x10⁵ дебай (для сравнения молекула воды имеет всего 1,84 дебай)

    Для случая показанного на рис. 1 численное значение наведенного дипольный момента задается формулой:

    m = qD, где q разделенный заряд, D диаметр частицы.

    Эта особенность делает клеточный электрофорез очень быстрым и электрокинетические эффекты хорошо видны в световой микроскоп. Однако, однонаправленные быстрые перемещения клеток в поле зрения микроскопа малоинформативные, т.к. измерение скорости перемещения затруднено. Для устранения этих неудобств применяют видоизменения клеточного электрофореза

Видоизменения клеточного электрофореза.

    Диэлектрофорез - движение частиц в неоднородном электрическом поле.

    Электрофорез применяется в основном для медленного разделения биологических молекул в однородном электрическом поле. Клеточный электрофорез происходит быстрее по времени и разделение клеток по каким-либо характеристикам затруднено, т.к. все клетки в результате воздействия однородного электрического поля перемещаются к соответствующему электроду. Применение диэлектрофореза позволяет устранить этот недостаток. При этом используют электроды различной формы, которые создают неоднородное электрическое поле. В простейшем случае это могут быть электроды пластинчатой и игольчатой формы. У игольчатого электрода формируется поле большей напряженности, а у пластинчатого - меньшей. Индуцированный диполь (клетка) в неоднородном поле ведет себя по-разному в зависимости от своих электрических характеристик.

(а)	(б)
Рисунок 2.

    Показаны две частицы в неоднородном электрическом поле. Поляризуемость первой частицы больше чем окружающей ее среды. При взаимодействии с полем возникает результирующая сила которая сдвигает клетку в сторону большей напряженности поля (т.е. к игольчатому электроду). В отличие от второй частицы, которая менее поляризуема и смещается в сторону меньшей напряженности поля (т.е. к пластинчатому электроду).

    Этот эффект объясняется следующим. Липидный бислой, который составляет мембрану клетки, можно представить в виде плоского жидкостного конденсатора. Его пластины - это слои липидов, которые имеют некоторое сопротивление. Весь конденсатор имеет некоторую емкость и характеризуется определенным емкостным сопротивлением. Если живую клетку поместить в электрическое поле, то неповрежденная мембрана представляет собой барьер для проникновения поля внутрь клетки (эта ситуация показана на рис 2б). Вклад в общий дипольный момент, в большей степени, вносит смещение двойного электрического слоя вокруг клетки. В результате дипольный момент клетки совпадает с направлением поля. Как известно, одноименные полюса отталкиваются, следовательно электроды, формирующие электрическое поле будут создавать силы отталкивания для диполя. Но благодаря различиям в конфигурации электродов силы отталкивания не уравновешиваются и направление движения диполя будет из области высокой напряженности поля в область низкой напряженности. Т.е. к пластинчатому электроду, против направления силовых линий поля.

    Если клетка мертвая или имеет меньшее емкостное сопротивление мембраны (как правило это случается при повреждении мембраны, например вирусами), то поле может свободно проникать внутрь клетки (эта ситуация рассмотрена на рис.2а). Цитоплазма клетки обычно содержит больше солей и веществ, следовательно ее проводимость больше чем у окружающей среды. Электрическое поле проникая в более проводящую среду сильно поляризует такую клетку и общий дипольный момент противоположен полю. Затем, как и в первом случае, этот вызванный диполь притягивается к соответствующим электродам, но поскольку форма их различна, то направление движения определяется полем большей напряженности. В результате мертвые клетки движутся по направлению электрического поля.

    Применение электродов различных форм эффективно при разделении смеси частиц. На рис. 3 показаны электроды для диэлектрофореза, которые применяются при исследованиях различных частиц и клеток в Университете Глазго (подробно на http://www.gla.ac.uk/schools/engineering/)

Зубчатая электродная сетка
Электроды изготовляются с величиной Х порядка 1-100 микрометра

Пильчатая электродная сетка
Электроды изготовляются с величиной Х порядка 1-100 микрометра
Рисунок 3. Электродные сетки для электрофореза.

    Наиболее простые примеры использования данного метода (для разделения смеси клеток):

    1. Бактерии делятся на Грамм-положительные и Грамм-отрицательные. Грамм-положительные бактерии имеют очень толстую клеточную стенку (до 50% объема клетки). Она построена из пептидогликанов и тейхоевых кислот, которые образуют подобие сетки. Грамм-отрицательные бактерии более совершенны. Их главное отличие - полное отсутствие тейхоевых кислот в клеточной оболочке, которая построена главным образом из липидов и белков. Строение и состав оболочек определяет их электрические свойства. Как правило (но не всегда), клеточные стенки Гр(-) бактерий имеют меньшую проводимость, чем Гр(+). Это свойство может быть использовано при разделении смеси бактерий.

    2. Во многих отраслях медицины и биотехнологии возникает необходимость разделения живых и мертвых клеток. Живые клетки имеют неповрежденные мембраны и обладают способностью поддерживать гомеостаз внутренней среды за счет избирательного поглощения ионов. Мертвые клетки имеют поврежденные или деградированные мембраны которые свободно пропускают ионы внутрь и тем самым приближают электрические характеристики клеток к таковым внешней среды. Эти различия в свойствах позволяют разделять клетки с помощью диэлектрофореза.

    На рис. 4 показано разделение клеток при диэлектрофорезе с использованием зубчатых электродов.

Рисунок 4.

    Разделение клеток. Клетки с большей проводимостью сосредоточиваются в областях с высокой напряженностью поля, образуя скопления в виде бус (на рис. красные, например Гр(+) бактерии, мертвые клетки). Клетки с меньшей проводимостью сосредоточиваются в областях с низкой напряженностью поля, образуя при этом характерные дельтовидные скопления (на рис. синие, например Гр(-) бактерии, живые клетки). В данном случае преимуществом зубчатых электродов является возможность дальнейшего разделения клеток с помощью обычного промывания электродной сетки.

Электроротация

    Электроротация - вращение частиц в однородном знакопеременном ротационном электрическом поле.

    Для создания ротационного поля необходимо как минимум 4 электрода, расположенных крестообразно как показано на рис. 5

Составной электрод для электроротации
Электрод изготавливается с величиной Х - 6 мкм, Y - 2 мкм
Рисунок 5. Составной электрод для электроротации.

    На противоположно расположенные электроды подается знакопеременное напряжение, как и при знакопеременном клеточном электрофорезе, при этом на смежные электроды подается такое же напряжение, но со сдвигом фаз в 90^о. В результате создается ротационное электрическое поле которое вызывает крутящий момент на частице в соответствии с формулой:

    Формула показывает, что вращающий момент зависит только от вектора электрического поля и не зависит от градиента напряженности. Абсолютное значение разницы фаз между искусственным диполем (m) и вектором напряженности электрического поля (E) определяет абсолютное значение вращающего момента, достигая максимума при различии фаз в 90^о и минимума при 0^о. Таким образом частица находясь в ротационном электрическом поле будет поворачиваться в противофазе с полем. Физическое объяснение этого, возможно интуитивно неправильного результата, дается на рис.6

Рисунок 6.

    Электроротация используется для выяснения электрических характеристик клеток. Эти характеристики зависят от внешних воздействий и по их изменению можно судить о физиологическом состоянии клетки. Например, для биологического тестирования загрязненности воды. Если поместить клетку в неблагоприятную для нее среду, то клетка отвечает на это изменением метаболизма. Т.к. метаболические реакции протекают на мембранах, то изменение их свойств приведет к изменению искусственного дипольного момента. Что повлияет на характер движения клеток в ротационном поле. Явление электроротации можно использовать для выяснения специфичности белков, антител и других биологических молекул. Так называемый электроротационный тест основан на различных электрокинетических характеристиках исследуемых частиц. На рис.7 показаны графики ротации частиц из пенопласта покрытых исследуемыми белками.

Рисунок 7.
Частицы покрытые белковым комплексом антигенов 1 типа
Частицы покрытые белковым комплексом антигенов 2 типа
Не покрытые частицы, служат для контроля.

    На представленном рисунке видны различия в скорости вращения частиц. Эта характеристика может использоваться при наблюдении смеси клеток или частиц, для выявления индивидуальных особенностей и возможного распознавания клеток.

Диэлектрофорез "бегущая волна"

    Подбирая форму и количество электродов можно добиться совместного действия диэлектрофоретических и электроротационных сил. Их совместное действие приводит к интересным электрокинетическим эффектам. Типичная электродная сетка для ДБВ представлена на рис. 8

Рисунок 8.

    Бегущая волна образуется на электродах при подаче на них знакопеременного напряжения с фазой показанной на рисунке. (а) Ожидаемое направление движения для живой клетки. (в) Клетка пойманная положительными диэлектрофоретическими силами. (г) Движение мертвой клетки.

    Это очень чувствительная методика для разделения клеток и других микроскопических частиц различных типов. Например, жизнеспособные клетки дрожжей передвигаются против направления бегущего электрического поля, в то время как мертвые клетки - в противоположную сторону, эффективность разделения при этом приближается к 100%. Таким образом, данная методика может использоваться как очень чувствительная технология для разделения микрочастиц. Частицы или клетки даже с очень небольшими различиями в электрических характеристиках разделяются на электродных сетках на значительное расстояние.

Источники информации

Laboratory-on-a-Chip Research Group
Institute of Molecular & Biomolecular Electronics
University of Wales Bangor

AC Electrokinetics
Bioelectronics and molecular electronics
University of Glasgow