"МИС-РТ" - 2004. Сборник №34-2-2


Новый экспрессный амперометрический способ
определения антиоксидантной активности
растительных лекарственных препаратов,
биологически активных добавок и напитков

Яшин А.Я., Яшин Я.И., * Пахомов В.П., Черноусова Н.И.

ОАО Научно-производственное объединение "Химавтоматика",
г. Москва, тел. (+7-095) 181-5327, тел./факс. (+7-095) 181-6322,
,
http://www.chimavtomatika.ru
* Институт клинической фармакологии Научного центра экспертизы средств медицинского применения


ВВЕДЕНИЕ

Уменьшение защитных сил организма человека, в т.ч. снижение активности антиоксидантной системы, происходит за счёт воздействия радиации, УФ-облучения, инфекционных болезней, постоянных стрессов, курения, алкоголизма, некачественного питания. В результате этих процессов в организме возрастает концентрация свободных радикалов (супероксидный анион-радикал, гидропероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксил радикал и др.), избыток которых приводит к серьёзным патологическим изменениям и заболеваниям (атеросклероз, злокачественные образования, преждевременное старение). Уменьшить вредное воздействие на организм свободных радикалов возможно при систематическом употреблении некоторых продуктов питания (соки, мёд, чай, фрукты, овощи и др.), некоторых биологически активных добавок, лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантной активностью.

ОАО НПО "Химавтоматика" совместно с Институтом Клинической Фармакологии НЦ ЭСМП РФ разработали оригинальный способ определения антиоксидантной активности лекарственных препаратов, продуктов питания и биологически активных веществ. Антиоксидантная активность связана с присутствием в указанных продуктах природных соединений, в частности флавоноидов, оксикислот и других соединений. Научно доказано, что природные фенольные соединения обладают антисклеротическим, антиканцерогенным и антиаллергическим действием [1-3].

Антиоксиданты защищают клеточные структуры от повреждения их свободными радикалами, это предохраняет организм человека от болезней [4-8]

Цель настоящей работы описание возможностей нового универсального экспрессного метода определения антиоксидантной активности экстрактов лекарственных трав, напитков (чая, кофе, соков, вина, пива и др.), биологически активных добавок к пище и др. объектов.

Краткий обзор существующих методов оценки антиоксидантной активности Подробный обзор методов определения антиоксидантной активности опубликован в 2002 г. [9] В этом обзоре детально обсуждаются преимущества и недостатки известных химических методов. В заключение отмечается, что нет метода, позволяющего надежно определять суммарно в сложной смеси растительного происхождения антиоксиданты разных классов или полифункциональные антиоксиданты. Обзор методов определения антирадикальной активности in vitro, основанных на генерации свободных радикалов (пероксидные радикалы, перекиси липидов, синглетный кислород, супероксидный анионрадикал и др.) проведен в работах [10, 11]

Считается, что основным повреждающим свободным радикалом в биологических системах является гидроксильный радикал. Действие его изучается по флуориметрическому определению продуктов взаимодействия диацилпроизводных флуоресцеина с гидроксильным радикалом [10]. В работах вышеприведенных авторов изучена антирадикальная активность флавоноидов и их комбинаций в условиях генерации гидроксильных радикалов в присутствии плазмы крови.

В институте Биохимической физики им. Н.М. Эммануэля (руководитель работ Бурлакова Е.Б.) разработаны и активно применяются десятки разных методов определения антиоксидантной активности, из которых следует выделить модель с глицилтриптофаном и хемилюминесцентным детектированием, а также метод по поглощению кислорода исследуемым веществом [12].

Способ определения антиоксидантной активности окислением раствором 0,05 н перманганата калия в среде 0,24 н серной кислоты запатентован А.П. Арзамасцевым, В.П. Пахомовым и др.

 

ОПИСАНИЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

Амперометрический способ [13] основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом.

Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенным к нему. В качестве материала рабочего электрода используются: стеклоуглерод, золото, платина, серебро, медь, никель, палладий и др. Потенциал может устанавливаться в пределах от 0 до 2,5 В.

Известно, что амперометрический способ анализа обладает рядом преимуществ: низким пределом обнаружения, высокой селективностью (определяются только соединения, молекулы которых могут окисляться, другие соединения, присутствующие даже в больших концентрациях не определяются), малым объемом ячейки (0,1-5 мкл), простотой обслуживания.

В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные группы, предел их обнаружения на уровне 10-9 - 10-12 г, в благоприятных условиях некоторые соединения определяются на уровне 10-15 г (фемтограммов). Основные и наиболее активные природные антиоксиданты имеют фенольную природу. Это природные полифенолы, разные типы флавоноидов, фенольные оксикислоты, витамины и другие.

Таким образом, амперометрический способ наиболее подходящий метод для оценки антиоксидантной активности.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО СПОСОБА ЭКСПРЕССНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

Антиоксидантную активность трудно измерить по отношению к свободным радикалам непосредственно in vivo, поэтому действие антиоксидантов оценивается степенью его окисления in vitro.

К сожалению, описанные методы оценки антиоксидантной активности не универсальны, трудоемки, дороги, их трудно сравнивать.

Как указывалось в обзоре [9], существующие методы показывают сильно различающиеся значения антиоксидантной активности одних и тех же соединений. Вольтамперометрический метод [14] показывает, что антиоксидантная активность аскорбиновой кислоты, глюкозы и зеленого чая примерно на одном уровне. Электрохимическим методом in vitro показано, что антиоксидантная активность катехинов зеленого чая в 20 раз больше, чем витамина С и в 50 раз больше, чем витамина Е.

В таблице 1 приведены значения антиоксидантной активности, измеренные разными методами, которые в большинстве случаев не сопоставимы. В работе [9] сопоставлена антиоксидантная активность стандартных антиоксидантов: галловой кислоты, мочевой кислоты, тролокса и аскорбиновой кислоты, измеренная методами TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity), TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) и LDL окислением. Результаты были несопоставимы, особенно по галловой кислоте (сильнейший антиоксидант), для всех трех систем. Учитывая вышеприведенные сведения, можно заключить, что наиболее актуальная задача в области определения антиоксидантной активности - это создание универсального, экспрессного и сравнительно дешевого метода. По нашему мнению, из всех существующих методов амперометрический способ в наибольшей степени удовлетворяет этим требованиям. Особенно хорош амперометрический способ при сопоставлении антиоксидантной активности (АОА) разных лекарственных форм, напитков, БАДов и др. Некоторые из подобных сопоставлений приведены в таблицах 2-5.

В таблице 2 приведена АОА свежевыжатых соков фруктов и овощей (2 грамма сока разбавлялись 10 мл воды). В таблице 3 приведена АОА разных типов пчелиного меда. Мед был взят у пчеловодов на ярмарке меда в Москве. В таблице 4 приведена АОА разных видов хмеля, собранных в соответствии с ГОСТом. В таблице 5 приведена АОА некоторых типов бальзамов и эликсиров, взятых в упаковках производителя.

ВЫВОДЫ

Описан принцип действия и особенности нового амперометрического метода определения антиоксидантной активности разных продуктов. Сделано сравнение амперометрического метода с другими известными методами. Показано, что метод селективен к полифенолам, флавоноидам, оксикислотам и др. Приведены данные по антиоксидантной активности соков, мёда, хмеля, бальзамов и эликсиров, измеренные амперометрическим методом.

 

Таблица 1. Антиоксидантная активность флавоноидов, оксикислот, витаминов, фенольных соединений, определенная разными методами.
Соединения TEAC
[10, 11]
С1/2, мМ [10, 11] AOP, моль/моль [15] ARP моль/моль [15] амперо-
метрический способ
Стандарты
тролокс 1,0 1,05 - - -
аскорбиновая кислота 0,8 0,92 - - -
мочевая кислота 0,78 1,07 - - -
кверцетин 10,6 0,19 4763 11,1 3754
дигидрокверцетин - - - - 3924
рутин 4,8 0,28 617 1,18 767
a- токоферол - - - 4,1 -
галловая кислота 5,42 0,58 2684 12,5 3700
пирокатехин 0,49 2,14 - - -
фенол 0,34 3,15 - - -
мексидол - - - - 2224
Флавоноиды
нарингенин 1,3 1,76 63 0,02 -
генистеин 1,3 1,76 - - -
(+) катехин - - 2148 9,1 -
(-) эпикатехин - - 567 - -
(-) эпигаллокатехин - - 2538 - -
мирицетин - - 1600 - -
изокверцетин - - 832 8,6 -
Ароматические кислоты
кофейная 0,64 2,02 2860 9,1 -
феруловая - - 340 2,3 -
сиреневая - - 202 - -
ванилиновая - - 126 0,17 -
п-кумариновая - - 164 0,02 -

Примечание: AOP (antioxidant power), ARP (antiradical power), TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity)

 

Таблица 2. Антиоксидантная активность свежевыжатых соков фруктов и овощей

Наименование Отношения
(площадь исслед)/(площадь рутин)
1. лимон 7,86
2. чеснок 7,82
3. белая редька 6,86
4. свекла 6,61
5. гранат 5,984
6. грейпфрут 5,84
7. красный виноград 5,29
8. апельсин 4,5
9. мандарин 4,2
10. красный перец 4,1
11. лук 3,95
12. хурма 2,85

 

Таблица 3. Антиоксидантная активность пчелиного меда, собранного с различных медоносных растений (усреднённые результаты из 5-10 образцов, стандартный образец - рутин 0,01%)
П/п
Наименование меда АОА,
мг/г
1. Донник 2,68
2. Гречишный 2,31
3. Липовый 2,11
4. Луговой 1,96
5. Эспарцетовый 1,8
6. Цветочный 1,64
7. Белая акация 1,42
8. Расторопша 1,27

 

Таблица 4. Антиоксидантная активность соплодиев хмеля (стандартное вещество - дигидрокверцетин - 0,01%)
П/п
Сорт хмеля АОА,
мг/г
1. Крылатский 15,2
2. Михайловский 14,5
3. Подвязный 14,1
4. Челенджер 13,2
5. Истринский 12,2
6. Ранний 11,7
7. Дикий 11,7
8. Сумерь 11,6

 

Таблица 5. Антиоксидантная активность бальзамов (стандартное вещество - рутин 0,01%)
П/п
Название бальзама АОА,
мг/г
1. Тайга 14,1
2. Виватон 9,8
3. Ишимский 5,6
4. Демимдовсий 4,8
5. Алтайский 1,2
6. Jagermeister 1,2

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Свободные радикалы в биологии. Часть 1./ Под редакцией акад. Н.М. Эммануэля М. Мир-1979-с308.
  2. Kehrer J., Free Radicals as Mediators of Tissue Injury and Desease, Critical Reviews in Toxicology, 1993, v23, p21-48.
  3. Acworth I.N., Bailey B. The Handbook of Oxidative Metabolism ESA. Inc. 1995.
  4. Osawa T. in Huang M.T., C.T. Ho, C.Y. Lee (Eds) Phenolic Compounds in Foods and Health. II. Antioxidant and Cancer Prevention, American Chemical Society, Washington DC. 1992, p135.
  5. Natural Antioxidants-Chemistry, Health Effects and Applications, ed F. Shanidi, AOCS Press. Champaigh , 1997, ch.24.
  6. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford University Press, New York, 3rd edn. 1999.
  7. Kumpulainen J.T. and Salonen J.T. Natural Antioxidants and Food Quality in Atherosclerosis and Cancer Prevention, Royal Society of Chemistry, Campridge 1996.
  8. D.L. Modhavi, S.S. Deshpande and D.K. Salunkhe, Food Antioxidants: Technological, Toxicological and Health Perspective, Marcel Dekker, New York 1996, p5-64.
  9. Antolovich M., Prenzler P.D., Mc Donald E., Robards K. Methods for testing antioxidant activity, Analyst, 2002, v127, p183-198.
  10. Макарова М.Н., Кузнецов А.С., Зенкевич И.Г., Макаров В.Г. Флуориметрический метод оценки антиоксидантной активности природных антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам. Материалы VI Международного съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения", 4-6 июля 2002 г., СПб-2002-с437-441.
  11. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Зенкевич И.Г. Изучение антирадикальной активности индивидуальных флавоноидов и их комбинаций с другими антиоксидантами в опытах in vitro. Материалы VII Международного съезда Фитофарм 2003 "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения", СПб-Пушкин, 3-5 июля 2003 г., с216-222.
  12. Тезисы докладов VI Международной конференции "Биоантиоксидант" Под ред. Е.Б. Бурлаковой Москва 16-19 апреля 2002 г., с683.
  13. Пахомов В.П., Яшин Я.И., Яшин А.Я., Багирова В.Л., Арзамасцев А.П., Кукес В.Г., Ших Е.В. Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных соединений. Решение о выдаче патента на изобретение №2003123072/15 (024964). Дата подачи заявки 25.07.2003.
  14. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Гайсина Г.Х., Будников Г.К. Применение электрогенерированного брома для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе. Ж. аналит. химии, 2002, т57, №6, с666-670.
  15. Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection. Talanta 2000, v.51, p.709-716.

Summary

А principle of operation and device of a new amperometric method for determination of the antioxidant activity of flavonoids, phenolic acids, tocopherols is described. Method is essentially useful for comparative expert estimation of the antioxidant activity of drugs, juices, foodstuff and biologically active supplements.