"МИС-РТ" - 2002. Сборник №27-1.

Влияние низко-интенсивного
лазерного излучения на активность
процесса фагоцитоза.

Д.В. Рудик, Е.И. Тихомирова, И.О. Бугаева ( sb27-1.zip)
Кафедра микробиологии Саратовского Государственного Университета.
RudikDV@info.sgu.ru

----В последние годы внимание многих исследователей привлекают физические методы воздействия на биосистему, в частности использование различных видов лазерного излучения. В последнее время получили широкое распространение полупроводниковые лазерные приборы, излучающие в ближнем инфракрасном и красном диапазонах. Эти лазеры в десятки раз экономичнее, значительно меньше по габаритам и весу, их параметры регулируются без дополнительных приспособлений, а длина волны (от 600 до 1400 нм) позволяет доставить энергию к тканям и органам человека на глубину до 5 -6 см [6].

----У излучения полупроводниковых лазеров достаточно широкий спектр действия. Это излучение активизирует многие процессы в организме, повышая энергетический обмен, оказывает противовоспалительное, анальгезирующие действие, стимулирует репаративные процессы [1,2,6].

----Лазерное излучение по данным литературы вызывает изменение кислородного баланса и активацию окислительно-восстановительных процессов, подавление перекисного окисления липидов (ПОЛ) и образование свободных радикалов, потенцирование действия антиоксидантов. При этом происходит повышение активности каталазы, пероксидазы, активация других ферментативных систем клетки, в частности, сукцинат-дегидрогеназы, НАД-Н2, НАДФ-Н2, АТФазы, альдолазы кислой и щелочной фосфатаз. Ряд концепций, объясняющих биологические эффекты НИЛИ, фиксируют внимание на его способности изменять структуру и конформационную подвижность элементов биомембран [6], а также возможности изменения структуры мезоморфной жидкокристаллической матрицы [5].

----Результаты исследований относительно стимуляции системы иммунитета при лазерном воздействии весьма противоречивы, поскольку разные авторы используют различные виды излучения, дозы и режимы воздействия.

----Базой для развертывания специфических - имунных процессов, являются более древние реакции, связанные с воспалением. Поскольку они присутствуют в любом организме до начала агрессии, их называют естественными. Основной группой клеток, обеспечивающих реакции естественного иммунитета, являются фагоцитирующие лейкоциты. По особенностям морфологии и функции их разделяют на мононуклеарные фагоциты и гранулоциты, что примерно соответствует предложенному И.И. Мечниковым разделению на макро- и микрофаги. Особенно многообразна роль главных эффекторных клеток этой группы - макрофагов. Макрофаги в отличие от гранулоцитов мобилизуются позже (через часы, сутки), но обладают более значительным фагоцитарным потенциалом и разнообразным спектром эффекторных функций. Основным проявлением активации макрофагов является повышение их фагоцитарной способности и эффективности (завершенности) фагоцитоза.

----Цель настоящего исследования: изучить влияние красного и инфракрасного лазерного излучения на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов in vitro, оценить эффективность (завершенность) фагоцитоза.

Материалы и методы

----Макрофаги выделяли по общепринятой методике [4]. Полученный от белых мышей перитонеальный экссудат центрифугировали при 5 000 g в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендировали в 2 - 3 мл среды 199 и переносили в стерильные пробирки с покровными стеклами, на которые адсорбировались макрофаги. Концентрацию полученных клеток подсчитывали в камере Горяева и определяли % жизнеспособности [3].

----Затем к полученным перитонеальным макрофагам (ПМФ) добавляли взвесь суточной культуры Staphylococcus aureus (клинический штамм №9) из расчета 1 макрофаг на 50 бактериальных клеток (1:50).

----После 30 мин инкубации при температуре 37?С стекла с адсорбированными макрофагами подвергали действию НИЛИ в разных режимах.

----Для изучения влияния НИЛИ на процесс фагоцитоза нами была собрана установка на базе микроскопа МБР-13 со встроенными полупроводниковыми лазерными излучателями. Воздействие осуществляли двумя типами излучения: инфракрасными лучами в диапазоне 810 - 890 нм и лучами красной области спектра в диапазоне 665 - 667 нм на макрофаги в стадии адгезии и фаголизосомы в течение 1 и 30 сек. Контролем служили не облученные макрофаги.

----Через 30 мин, 1 час и 6 часов последующей инкубации обработанных НИЛИ клеток при 37?С покровные стекла с адсорбированными фагоцитирующими макрофагами фиксировали в смеси Никифорова. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, с использованием окуляра х10 и иммерсионного объектива х90 определяли число активных макрофагов на разных стадиях фагоцитоза. Расчитывали фагоцитарный индекс (ФИ), а также индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) [3].

Результаты и их обсуждение.

----При воздействии инфракрасного лазерного излучения (ИКИ) в течение 1 секунды количество активных макрофагов на стадии адгезии увеличивалось от 18 ± 0,1% в контроле до 25±0,4% (РР0,05). Через 1 час после ИК лазерного воздействия (на стадии фаголизосомы) количество активных макрофагов возросло по сравнению с контролем (24±0,1%) и соответствовало 42±1,2%(Р Р0,05). Через 6 часов (на стадии киллинга бактерий) процентное содержание активно фагоцитирующих клеток перитонеальной жидкости, облученных ИК лазером животных , возрастало до 56±0,8%.

 

Таблица 1. Оценка фагоцитарной активности макрофагов перитонеальной жидкости (M±m) в %.

Эксперимент Стадии фагоцитоза Примечание
30 сек стадия адгезии 1 час стадия фаголизосомы 6 часов стадия киллинга бактерий
Контроль 18 ± 0,1 24 ± 0,1 32 ± 0,6 Без воздействия НИЛИ
Красное излучение(1 сек) 14 ± 0,1 21 ± 0,5 17 ± 0,5* Угнетение активности ПМФ
Красное излучение(30 сек) 12 ± 0,5 Большинство клеток разрушено Сильное угнетение активности ПМФ
Инфракрасное излучение(1 сек) 25 ± 0,4* 42 ± 1,2* 56 ± 0,8* Усиление стадии адгезии, усиление киллинга бактерий
Инфракрасное излучение(30 сек) 28 ± 0,4* 39 ± 0,7* 82 ± 0,1* Эффект "облепленных бактериями макрофагов", значительное усиление киллинга бактерий

* - наличие достоверности при уровне значимости РР0,05.

 

 

----Использование ИКИ с экспозицией 30 секунд приводило к усилению процессов адгезии перитонеальных макрофагов in vitro. Через 30 минут после облучения мы наблюдали т.н. эффект "облепленных бактериями макрофагов". Количество активных клеток увеличивалось (28 ± 0,4%) по сравнению с контролем(18 ± 0,1%) Р Р0,05. Через 6 часов после лазерного воздействия в значительной степени усиливался киллинг бактерий, регистрировались самые высокие значения индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ) (Рис.1) на фоне резкого увеличения количества активно фагоцитирующих макрофагов (82 ± 1,1% и 32 ± 0,6% в контроле, РР 0,01).

----Значительных изменений в активности процесса фагоцитоза, при воздействии лучами красной области спектра в течение 1 сек, выявлено не было, наблюдалось некоторое снижение активности перитонеальных макрофагов по сравнению с контролем (табл).

----Увеличение экспозиции излучения в красном диапазоне до 30 сек приводило к разрушению большинства клеток и подавлению процесса фагоцитоза in vitro (табл ).

----Детальное микроскопирование фагоцитирующих макрофагов позволило установить, что инфракрасное излучение при экспозиции 30 сек усиливает стадию адгезии. Анализ адгезивных свойств фагоцитирующих клеток определяет способность последних мигрировать в зону проникновения патогенного агента и является достаточно информативным для оценки влияния НИЛИ на активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов. В событиях происходящих в мембране фагоцита при его адгезии, большая роль принадлежит актомиозиновой системе, а также переходам гел - золь в системе клеточных коллоидов [5]. Сокращение актиновых волокон и разжижение коллоида обеспечивает инвагинацию мембран и формирование фагосомы. Известно, что адгезия сопровождается синтезом и секрецией биологически активных веществ - цитокинов [7],что в конечном итоге приводит к интенсификации межклеточных взаимодействий, направленных на обеспечение иммунологической защиты. Активация адгезивных свойств, возможно, связана с усилением экспрессии специфических рецепторов на поверхности перитонеальных макрофагов.

----Эффект усиления бактериального киллинга, можно объяснить т.н. "кислородным взрывом" - образованием продуктов частичного восстановления кислорода (короткоживущего - синглетного), свободных радикалов, перекисей и других продуктов, обладающих высокой антимикробной активностью. Вероятно, в наших экспериментах, усиливался кислородзависимый киллинг бактерий. Воздействие на макрофаги ИК лазерного излучения, по-видимому, сопровождалось усилением метаболических процессов, приводящих к образованию бактерицидных субстанций (продуктов метаболизма кислорода и азота, ферментов). В результате, уничтожение агрессивных агентов реализовывалось в форме внутриклеточного (фагоцитоз), внеклеточного (за счет секреции бактерицидных продуктов), а возможно и контактного цитолиза.

Заключение

----Таким образом, нами показано, что НИЛИ инфракрасного диапазона оказывает непосредственное стимулирующие влияние на процессы фагоцитоза макрофагов in vitro, что выражается в интенсификации адгезии, захвата и переваривания микроорганизмов.

----Излучение в красной области спектра, по результатам наших исследований, не приводит к стимуляции фагоцитарной функции макрофагов перитонеальной жидкости in vitro, а напротив, подавляет ее.

 

    Литература

  1. Б.И.Кузник, И.В.Васильев, Н.Н.Цибиков. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М.: Медицина,1989.
  2. В.Е.Кузьмина, Ю.А.Варижников. Биологическое действие лазерного излучения. Межвуз.сб. науч. работ: Куйбышев, 1984,С.51 - 60.
  3. Практикум по иммунологии. Учебное пособие. Под ред. И.А.Кондратьевой, В.Д.Самуилова. М.: МГУ,2001,224с.
  4. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы.1990, Москва "Мир"
  5. Минц Р.И., Скопинов С.А. // Действие электоромагнитного излучения на биологические объекты и лазерная медицина. Владивосток,1989, С.6 - 41.
  6. В.В.Тучин. Лазеры и волокнистая оптика в биомедицинских исследованиях. Изд. Саратовского ун - та., 1998.
  7. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М:. "Медицина", 1999.